Lecteur d’ADN de poche utilisé pour scanner des séquence du génome humain

Séquence sur un bâton. Agrandir / Séquence sur un bâton.Oxford Nanopore

Il y a quelques années, une société appelée Oxford Nanopore l’a annoncé développait une manière radicalement différente de séquencer l’ADN. Ses approche impliquait la prise de brins simples de la double hélice et les bourrer à travers un pore de protéines. Avec un peu de courant circulant dans le pore, les quatre bases de l’ADN ont chacune créé un changement distinct (si minuscule) de la tension lorsqu’il est passé. Ceux-ci pourraient être utilisés pour lire l’ADN une base à la fois, remué à travers le pore.

Après plusieurs années de lenteur des progrès, Oxford Nanopore a annoncé que son matériel de séquençage serait aussi distinctif que son wetware: un périphérique USB qui peut être installé confortablement dans une personne main. Lorsque les premiers appareils ont été distribués aux utilisateurs, il est devenu évident que l’appareil avait des avantages et des inconvénients. Du côté positif, l’appareil était rapide et pourrait être utilisé sans nécessiter une grande installation soutiens le. Il peut également lire de très longs segments d’ADN à la fois. Mais l’inconvénient était considérable: il y avait beaucoup d’erreurs.

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Avec quelques années d’expérience, les gens commencent maintenant à apprendre tirer le meilleur parti des appareils, comme le démontre un nouveau document en que les chercheurs utilisent pour aider à séquencer un génome humain. En utilisant les longues lectures de la machine – dans un cas, près de 900 000 bases sur une Molécule d’ADN – les auteurs ont pu obtenir des données sur des zones de la génome humain qui a résisté à la caractérisation avant. Et ils étaient capable de distinguer les deux ensembles de chromosomes (un de maman, un de papa) et localiser les zones de contrôle épigénétique dans de nombreux zones du génome.

À la lumière de toutes les informations distinctes qu’il peut fournir, le le taux d’erreur de la machine semble être moins un problème.

Erreurs et corrections

Nous avons des machines de séquençage de l’ADN qui font très peu d’erreurs. Malheureusement, ils ne sont bons que pour lire l’ADN en morceaux d’environ 200 bases ou plus. Le logiciel informatique doit reconnaître les cas dans que ces petits morceaux se chevauchent et les utilisent pour construire plus grande des séquences. Ce processus échoue lorsque l’ADN est répétitif ou très complexe. des séquences similaires apparaissent dans plusieurs régions du génome – la le logiciel n’a tout simplement aucun moyen de dire ce qui se passe où.

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Comme nous l’avons vu avec le génome axolotl, il est possible d’utiliser plus longtemps, lectures sujettes aux erreurs pour donner un sens au désordre. La haute précision méthode fournit une séquence, tandis que les lectures plus longues nous disent comment les séquences se lient en gros morceaux. Il y aura toujours des lacunes, mais ils seront moins nombreux et plus de séquences seront trouvées dans les grands des morceaux par opposition à de petits fragments. Alors que le génome axolotl s’appuie sur des machines de Pacific Biosystems, le système nanopore fonctionnerait à cet égard aussi.

Ou du moins ça devrait. Une partie de l’objectif du nouveau document était de confirmez cela, et une grande partie du document consiste à déterminer comment obtenir la meilleure séquence possible à partir des nanopores des auteurs. Pour Par exemple, ils ont essayé deux logiciels différents pour interpréter les données de tension sortant de leur machine et a constaté qu’un package open source développé par la communauté utilisant un réseau de neurones a donné les meilleures données. La combinaison de nanopores se lit avec plus courte, des fragments de haute qualité ont augmenté la précision globale du génome assemblage à 99,88 pour cent, ce qui montre que cela fonctionne.

Mais les chercheurs sont allés bien au-delà. À lui seul, le séquence de nanopores avait un taux de précision de seulement 92 pour cent. Quand combinés, ayant plusieurs lectures de la même séquence à partir du même La machine a amélioré la précision au-dessus de 97%. Un logiciel séparé le paquet pourrait alors comparer les cas où différentes lectures n’étaient pas d’accord et prendre une décision quant à ceux qui sont susceptibles d’avoir raison; cette précision accrue jusqu’à 99,44%. Ce n’est pas aussi bon que d’avoir lectures courtes et de haute qualité, mais suffisamment proches pour de nombreuses applications. L’ajout des lectures courtes de haute qualité à cette précision accrue 99,96 pour cent.

Les nanopores offrent également des avantages très distincts. Pour Par exemple, l’activité des gènes peut être altérée par ce qu’on appelle modifications épigénétiques – une modification chimique de certaines bases qui ne changez pas la séquence d’ADN. Ces modifications modifient également légèrement les lectures de tension lors du passage d’une base, permettant chercheurs pour identifier où ils se sont déroulés dans le génome.

Aller long

Nous hériterons également de deux copies de chaque chromosome (à l’exception du X et Y des hommes): un de maman et un de papa. Alors que ces copies sont différents, la plupart de l’ADN sous-jacent est identique à long s’étire, rendant impossible l’utilisation de lectures d’ADN courtes pour déterminer quel chromosome est quel. En conséquence, pendant que vous pouvez dire où les différences sont présentes, il a été impossible de dire dont les différences ont été héritées ensemble, sur le même chromosome. Les longues lectures de nanopores rendent cela possible.

Enfin, les chercheurs ont décidé de faire les lectures aussi longtemps que possible. L’ADN est une longue molécule mince et des solutions manipulatrices de long ADN a tendance à le casser en petits fragments, comme le mouvement du fluide créera des forces de cisaillement et d’étirement. Si vous êtes vraiment prudent, cependant, ceux-ci peuvent être minimisés. Quand les auteurs pris ces précautions, la longueur de lecture typique fournie par le la machine à nanopores a tiré jusqu’à plus de 100 000 bases; une lecture atteint 882 000.

C’était assez grand pour couvrir certaines lacunes laissées par le projet original qui séquencait le génome humain. L’un d’entre eux était 50 000 bases de long et inclus une duplication d’un gène. Un autre avait huit copies d’une séquence répétée en succession rapide. Heures supplémentaires, il devrait être possible d’utiliser cette approche pour vraiment apporter la génome à l’achèvement.

Les travaux ont toutefois mis en évidence certaines lacunes sur le côté séquence. Un format de fichier commun utilisé pour contenir des données ADN, pour Par exemple, n’est pas spécifié pour gérer des séquences aussi longues. En raison de cela, certains logiciels d’analyse ne pouvaient pas fonctionner avec les lectures nanopore du tout. À la suite de ces problèmes de compatibilité, l’équipe a été forcé de s’appuyer sur un algorithme très gourmand en ressources processeur leur analyse.

Les résultats impressionnants de cette analyse suggère qu’il vaudrait la peine de faire l’effort de se faire le logiciel à jour.

Nature Biotechnology, 2017. DOI: 10.1038 / nbt.4060 (À propos de DOIs).

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